Tez Arşivi

Tez aramanızı kolaylaştıracak arama motoru. Yazar, danışman, başlık ve özete göre tezleri arayabilirsiniz.


Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Bölümü

A comparative study for the production of recombinant intracellular glucose isomerase by Escherichia coli and Pichia pastoris

Rekombinant hücre içi glukoz izomeraz üretimi için Escherichia coli ve Pichia pastoris üretim potansiyellerinin kıyaslanması

Teze Git (tez.yok.gov.tr)

Bu tezin tam metni bu sitede bulunmamaktadır. Teze erişmek için tıklayın. Eğer tez bulunamazsa, YÖK Tez Merkezi tarama bölümünde 371702 tez numarasıyla arayabilirsiniz.

Özet:

In this M.Sc. study, intracellular thermostable glucose isomerase (EC 5.3.1.5) production capacities of two metabolically engineered microorganisms, Escherichia coli and Pichia pastoris, were investigated. In this context, to construct intracellular glucose isomerase (GI) producing recombinant P. pastoris, the cells were transfected with pPICZ-A expression vector containing GI coding gene (xylA) of Thermus thermophilus. After the confirmation of the transfection, effects of co-carbon source sorbitol were investigated. CS0=30 g L-1 initial sorbitol concentration was found as optimal condition in terms of the cell growth and GI activity. The highest cell concentration and volumetric activity were attained as CX= 4.2 g L-1 (t=36h) and A=792.9 U L-1 (t=24h), respectively; whereas the highest activity was obtained as A=545 U L-1 (24h) using methanol as the sole carbon source. In the second part of the study, the research focused on GI production using Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS carrying pRSETA::xylAint. Laboratory scale air-filtered shake bioreactor experiments were designed to determine the effects of carbon sources on the cell growth of E. coli. The highest cell concentration was obtained in CM0=30 g L-1 hydrolyzed molasses-based medium where the GI activity was A=2312 U L-1 being 3.17-fold higher than that of P. pastoris. Based on the revealed data, feeding strategy development experiments were carried out using E. coli. Effects of pulse and continuous feeding of molasses on GI production, the cell and by-product formations were investigated by four sets of pilot scale bioreactor experiments. The highest cell concentration was obtained as CX=17.9 g L-1 at t=28h with a pre-determined exponential feeding calculated for the specific growth rate of µ0=0.1 h-1. In terms of GI activity, the most prospering strategy was PM-0.05. In this strategy, one molasses pulse given at t=7h and continuous feeding of molasses started at t=10h with a pre-determined exponential feeding rate of µ0=0.05 h-1. The highest volumetric GI activity was obtained as A=29050 U L-1 at t=26h of the bioprocess with YX/S=0.20 g g-1 overall specific cell yield on subsrate and 48.8 g total substrate consumption.

Summary:

Bu yüksek lisans tez çalışmasında, metabolik tasarımla değiştirilmiş rekombinant Escherichia coli ve Pichia pastoris'in ısıya dayanıklı hücre içi glukoz izomeraz (EC 5.3.1.5) üretim kapasitelerinin kıyaslanması amaçlanmıştır. Önce metabolik mühendislik teknikleri kullanılarak, thermofil Thermus termophilus'tan alınmış glukoz izomeraz genini taşıyan pPIZC-A::xlyA plasmidi P. pastoris hücrelerine transfer edilmiştir. Transfeksiyon işleminin doğrulanmasının ardından, sadece metanol içeren ortamla rekombinant P. pastoris'in GI üretim kapasitesi araştırılmış ve A=545 U L-1 enzim aktivitesi elde edilmiştir. İkincil karbon kaynağı olarak sorbitolün GI enzimi üretimi ve hücre çoğalması üzerindeki etkisi araştırılmıştır. 30 g L-1 başlangıç sorbitol derişiminin hücre çoğalması ve enzim aktivitesi açısından en uygun koşul olduğu bulunmuştur. En yüksek hücre derişimi ve hacimsel aktivite, sırasıyla, CX=4.2 g L-1 (t=36st) ve A=792.9 U L-1 (t=24st) olarak elde edilmiştir. İkinci alt-araştırma programında, pRSETA::xylAint taşıyan Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS hücresiyle GI üretimi için laboratuvar ölçekli hava-filtreli çalkalamalı biyoreaktörlerde farklı karbon kaynaklarının hücre çoğalması üzerine etkisi araştırılmıştır. En yüksek hücre derişimi CM0=30 g L-1 hidrolizlenmiş melas içeren ortam ile elde edilmiştir. Bu üretim koşulundaki en yüksek GI aktivitesi A= 2312 U L-1 olarak bulunmuştur, bu değer P. pastoris ile elde edilen aktivitenin 3.17-katıdır. GI üretimini arttırmak için, dört pilot ölçekli yarı-kesikli biyoreaktör deneyi E. coli konak hücresi kullanılarak tasarlanmıştır. Biyoreaktör ortamına anlık melas beslenmesi ve yarı-kesikli besleme stratejilerinin enzim aktivitesi, hücre derişimi, yan ürün oluşumu üzerindeki etkileri incelenmiştir. En yüksek hücre derişimi CX=17.9 g L-1 olarak, µ0=0.1 st-1 spesifik çoğalma hızına göre hesaplanmış üstel yarı-kesikli melas beslemesi ile t=28st'te elde edilmiştir. GI aktivitesi açısından en başarılı besleme stratejisinin t=7st'te verilen anlık melas beslenmesinin ardından t=10st'te µ=0.05 st-1 spesifik çoğalma hızına göre başlatılan yarı-kesikli melas beslemesini içeren PM-0.05 stratejisi olduğu görülmüştür. En yüksek hacimsel GI aktivitesi A=29050 U L-1 olarak t=26st'te elde edilmiştir. Substrata bağlı hücre verimi YX/S=0.20 g g-1 ve toplam substrat tüketimi 48.8 g olarak hesaplanmıştır.