Tez Arşivi

Tez aramanızı kolaylaştıracak arama motoru. Yazar, danışman, başlık ve özetlere göre tezleri arayabilirsiniz.


İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Anabilim Dalı

2004

A novel approach to selection of inorganic binding polypeptides using ultrasonication during phage display methodology

İnorganik malzemelere bağlanan polipeptitlerin taranmasında yeni bir yaklaşım: Faj gösterim teknolojisinde ultrasonikasyon uygulaması

Bu tez, YÖK tez merkezinde bulunmaktadır. Teze erişmek için tıklayın. Eğer tez bulunamazsa, YÖK Tez Merkezi'ndeki tarama bölümünde tez numarasını arayabilirsiniz. Tez numarası: 152317

Tezi Bul
Özet:

inorganik malzemelere bağlanan polİpeptttlerin taranmasında yeni bir yaklaşım: faj gösterim teknolojisinde ultrasonikasyon uygulaması ÖZET Nano-malzemelerin sentezlenmesinde inorganik malzemelere özgün olarak bağlanan peptîtlerin biyomoleküler birleştirici olarak kullanılması nano- ve nanobiyoteknoloji alanlanna yeni yaklaşımlar sunmaktadır. Seçilen bir inorganik malzemeye özgün olarak bağlanan polipeptitlerin taranmasında kullanılan yöntemlerden biri de kombinatoriyel biyoloji yöntemlerine dayalı moleküler kütüphane tarama tekniği olan faj gösterim sistemidir. Soy metaller, oksitler ve yan iletkenlere yapışan polipeptitlerin faj gösterim yöntemiyle taranmasına dair yapılan çalışmalar son yıllarda giderek artmaktadır. Ancak faj gösterim sisteminde karşılaşılan bazı problemler mevcuttur. Uzun süren bir yöntem olmasının yam sıra bu yöntemin inorganik yüzeye yapışan polipeptitlerin ne kadarım sökebildiği tam olarak bilinememektedir. Bu nedenle daha güvenilir ve kısa sürede sonuç alınabilecek yeni yöntemlere gereksinim vardır. Bu araştırmada faj gösterim yönteminin yarattığı kısıtları aşabilmek için yeni bir yaklaşım olarak ultrasonikasyon teknolojisi önerilmektedir. Faj gösterim yönteminde inorganik yüzeye özgün olarak bağlanan fajlar yüzeyden etkili kimyasallar (bazlar, asitler) kullanılarak toplanmaktadır. Yüzey temizliğinde sıkça kullanılan ultrasonikasyon yöntemi faj gösterim yöntemindeki kimyasal elusyona alternatif olarak düşünülmüş ve ultrasonikasyonun faj gösterim tekniğinde uygulanan kimyasal elusyonu destekleyici bir yöntem olarak kullanılma olasılığı araştırılmıştır. Ön deneylerde ultrasonik enerjinin fajlann canlılıkları ve dayanıklılıkları üzerindeki etkisi test edilmiştir. Ultrasonik dalgalar LABSONIC U (B.Braun Biotech Int.) ultrasonik probuyla üretilmiştir. Sonuçlar fajlann ultrasonikasyona dayanıklı olduğunu, hatta deneylerin gerçekleştirildiği polipropilen tüp içinde bulunan fajlann polipropilen yüzeyinden toplanabildiğini göstermektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda, faj gösterim yöntemi kullanılarak daha önce tanımlanmış bir malzeme olan 'mika' üzerinde tarama çalışmalan yapılmıştır. İki set tarama deneyi gerçekleştirilmiştir. Tek kristal yapılı muskovit mikaya özgün olarak bağlanan aminoasit dizilerinin taranmasında PLD.-C7C faj havuzu kullanılmıştır. İlk set deneylerde fajlann inorganik yüzeye bağlanması, özgün olmayan polipeptitlerin temizlenmesi, özgün bağlananların yüzeyden toplanması ve faj havuzu oluşturmak üzere çoğaltılması işlemlerini içeren döngü üç kere uygulanmıştır. Her döngüde fajlar yüzeyden kimyasal elusyon yöntemiyle toplanmıştır. Üçüncü döngüden sonra mika yüzeyi 30 saniyeliğine 150W ultrasonik enejiye maruz bırakılmıştır, ikinci set deneylerde ise mika yüzeyi dört kez kimyasal elusyonla temizlenmiş ve her kimyasal elusyondan sonra yüzeye ultrasonikasyon uygulanmıştır. İlk set deneylerde uygulanan ultrasonikasyon parametreleri ikinci set deneylerde sabit tutulmuştur. İki set tarama deneylerinin ardından, sadece kimyasal ıxelusyonla elde edilen sonuçlarla kimyasaldan sonra ultrasonikasyon elusyonunun uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar karşılaştınlmıştır. Dizileri belirlenen mikaya özgün polipeptitlerin bağlanma verimliliği Horasan mikroskobu deneyleriyle doğrulanmıştır. Kimyasal elusyondan sonraki sonikasyon uygulamasıyla yüzeyden toplanan mikaya özgün polipeptitlerin sadece kimyasal elusyonla toplanan polipeptitlere oranla yüzeye dana iyi bağlandığı gözlenmiştir. Ayrıca florasan mikroskobu deney sonuçlan göstermektedir ki; ultrasonikasyon uygulaması kimyasal elusyona oranla daha kısa sürede sonuç vermesi açısından da umut vaadetmektedir. Literatürde bir ilk olması nedeniyle bu çalışmanın gelecekte bu konu kapsamında yapılacak araştırmalara yol gösterici olması beklenmektedir.

Summary:

A NOVEL APPROACH TO SELECTION OF INORGANIC-BINDING POLYPEPTIDES USING ULTRASONICATION DURING PHAGE DISPLAY METHODOLOGY SUMMARY Genetically engineered polypeptides for inorganics (GEPIs) offer a novel way of using biomolecular linkers in the synthesis and assembly of materials structures for use in nano- and bionanotechnology. Phage Display as a combinatorial biology based molecular library method is one of the approaches for the selection of polypeptides that specifically bind to a given inorganic surface. There has been increasing amount of studies in the recent years focused on the selection of GEPIs from noble metals, oxides and semiconductors using phage display methodology. However, it has certain limitations like time consumption, and error prone effect. More rapid and reliable novel methodologies for selection purposes are needed in the use of phage display molecular libraries. In this research, the effect of ultrasound is suggested as a new approach to overcome the limitations of phage display methodology. Since ultrasonication has common use in surface cleaning, it is considered as an alternative method to chemical elution which is based on the removal of phage from inorganic surface using strong chemicals (bases or acids). In the present study, experiments are performed to investigate the probability of using ultrasonication as a supplementary method to chemical elution in phage display methodology. In the preliminary experiments, the influence of ultrasound power on phage viability and stability is tested. Ultrasonic waves are generated by ultrasonication probe LABSONIC U (B. Braun Biotech International). Results of the initial studies showed that phage could be eluted without loosing its stability from microfiige tube made of polypropylene via ultrasound effect. In the next stage of the studies, results are verified in a known phage display system 'mica'. Mica binding sequences are selected from Ph.D.-C7C library. Two screening experiments are performed. In the 1st screen three biopanning rounds of phage display protocol are applied onto single crystal muscovite mica. Chemical elution is used in each round. After the 3rd round chemically eluted mica surface is exposed to 150W sonication energy for 30 sec. In the 2nd screen four chemical elution rounds are performed. Ultrasound is applied onto mica surface after each round. Ultrasonication parameters applied in the 1st screen are kept constant in the 2nd screen. Results of only chemically eluted and chemically+sono eluted sequences are compared. Binding efficiency of determined sequences are verified by fluorescence microscopy experiments based on immunolabelling techniques. Results of both screens demonstrate that stronger binders are removed from mica surface by the use of ultrasonication after chemical elution compared to binders which are obtained by xichemical elution only. Besides, ultrasonication could be very promising in selecting higher affinity and specifity phages in shorter period compared to chemical elution. In this study, use of ultrasonication on phage removal is shown for the first time as a novel approach and found to be very promising for the future applications. Xll