Tez Arşivi

Hakkımızda

Tez aramanızı kolaylaştıracak arama motoru. Yazar, danışman, başlık ve özete göre tezleri arayabilirsiniz.


İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Anabilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı

Alanine scanning on the active site of a novel esterase

Yeni bir esteraz enziminin aktif bölgesinde alanin taraması

Teze Git (tez.yok.gov.tr)

Bu tezin tam metni bu sitede bulunmamaktadır. Teze erişmek için tıklayın. Eğer tez bulunamazsa, YÖK Tez Merkezi tarama bölümünde 518305 tez numarasıyla arayabilirsiniz.

Özet:

Enzymes are widely used in industrial applications and most of them are in the protein structure. Modifications in the protein sequence and protein structure by protein engineering strategies are often used to improve the properties of enzymes. Through all studies such as the finding of new enzymes, characterization and optimization of conditions, efforts are being made to reduce the production cost of the enzyme and to produce it at a higher scale. Esterase enzyme is a hydrolase enzyme used in many fields such as food, industry, health, medicine, detergent industry. It has an α/β hydrolase fold. Due to the high demand of industrial esterase enzymes, attempts are made to characterize novel esterases and increase their properties by using protein engineering approaches. In this thesis, the predicted information about the 3-D structure of a novel esterase enzyme is sought to be elucidated by one of the protein engineering methods which is named as site directed mutagenesis. In previous studies the esterase-encoding gene, isolated from microorganism cultures collected from Acıgöl, was introduced into pET28-a vector and introduced into competent C43 cells for the production of high amount in the laboratory conditions. In this study, pET28-a plasmid containing esterase gene was used as a template DNA. Protein sequence translation of the esterase gene was performed with the ExPASY tool followed by sequence comparison using the SWISS Model software. The closest predicted 3-D structure and protein in the Protein Data Bank database were investigated, and the closest protein was found to be the esterase ybfF protein from Escherichia coli (Ec_ybfF) with 34% similarity. It was noticed that the amino acids (H234 and S206) in the active region of the esterase ybfF protein were similar to the amino acids (H237 and S87) in a particular region of the novel protein obtained in this study. Alanine scanning of these specific regionhas been used to confirm the hypothesis that the amino acids H237 and S87 are members of the catalytic triad of our novel esterase enzyme. The reason for replacing the target amino acids with alanine by PCR reaction with the primers designed by QuikChange® is that alanine does not enforce the electrostatic or H bond effects because of the uncharged methyl groups in its R group and not being heavy. In addition, protein folding and stability do not undergo severe change when compared to the wild-type protein in three-dimensional structure. The mutant amplicons were disrupted by DpnI, the methylation-sensitive restriction enzyme, to remove the unmutated DNA. Subsequently, transformation of DpnI-applied PCR products into C43 cells was performed. Cultures obtained were plated on LB agar plates containing 100 μg/ml kanamycin and incubated overnight at 37 ° C. After isolating the plasmids, agarose gel electrophoresis was performed. The samples were sequenced and then the protein expression steps were followed to check the mutants were constructed. After addition of 0.01 mM IPTG, expression was induced by incubation at 30 ° C for 6 hours. Purification of the proteins of the pET28 vector carrying the H237A and S87A mutant esterase gene was then performed by the 6xHis tag procedure and the control was performed by SDS PAGE analysis. After gene expression induction with IPTG, bands between 25-35 kDa for H237A and S87A were detected. The result was compatible with previous studies while the molecular weight of the esterases in the literature changes between 27-54 kDa. Centrifugal ultrafiltration was performed to purify the obtained protein. Concentration by Bradford protein analysis was measured as 1.3 mg/ml for S87A mutant esterase, 4.5 mg/ml for H237A mutant esterase and 5.5 mg/ml for wild type. Kinetic measurement analysis of wild-type and mutant enzymes was performed at pH 8 with wavelength at 410 nm in the presence of 1 mM Para-nitrophenol (pNP) as substrate. Triplicate enzymatic activity measurements of wild-type and mutant enzymes, each incubated for 20 minutes at 30 ° C, were performed in three independent experiment sets. The kinetic measurements showed that H237A mutant and S87A mutant esterase enzymes lost their activities. These results prove that Serine and Histidine at 87 and 237 positions respectively are members of the catalytic triad of novel esterase enzyme and they are responsible for the catalytic activity of the enzyme.

Summary:

Çeşitli kimyasal maddeleri sentezleyen enzimlerin özelliklerini değiştirmek, üretimini arttırmak için protein dizisi ve yapısında yapılan modifikasyonların tamamı protein mühendisliği alanına girmektedir. Protein mühendisliği çalışmaları, istenen molekülün kimyasal sentezini katalize eden enzimlerin özelliklerinin iyileştirilmesi için kullanılan rekombinant DNA teknolojilerini kapsar. Yeni enzimlerin bulunması, karakterizasyonu, koşulların optimize edilmesi gibi tüm çalışmalar sayesinde, enzim üretim maliyeti azaltılmaya ve daha yüksek ölçekte üretim yapılmaya çalışılmaktadır. Esteraz enzimi, α/β hidrolaz katlanmasına sahip olan ve ester bağlarının hidrolizini katalize eden hidrolaz sınıfı enzimlerindendir. Esterazlar, çeşitli karbon kaynaklarına ulaşmak için evrimsel olarak büyük substrat toleransları sergiledikleri düşünülen bitkilerde, hayvanlarda ve mikroorganizmalarda yaygın dağılıma sahiptirler. Organik solventlerde bile kararlılık gösterdiklerinden dolayı saf ürünlerin elde edilmesi için oldukça tercih edilen biyokatalizörlerdir. Gıda, sağlık, ilaç, deterjan endüstrisi gibi pek çok endüstriyel uygulamada, ester bağlarını hidrolize etme sürecinden faydalanılmaktadır. Endüstriyel alanda esteraz enzimine talep çok fazla olduğundan, yeni esteraz enzimlerinin eldesi ve protein mühendisliği yaklaşımlarıyla karakterizasyon çalışmaları devam etmektedir. Endüstriyel olarak enzimler üretilirken yüksek basınç, sıcaklık ve yüksek enerji gerektiren pH gibi koşulların sağlanması gerekli olabilir. Aynı zamanda, enzimlerin aktivitesini sabit tutmak ve koşulları sağlamak gibi sınırlamalar, endüstriyel enzim üretimini yüksek oranda etkiler. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek ve düşük maliyetle yüksek verim elde etmek için enzimlerin uygulama alanlarını arttırmak amacıyla protein mühendisliği yaklaşımları uygulanmaktadır. Protein mühendisliğinin üç farklı stratejisi; rasyonel tasarım, yönlendirilmiş evrim ve yarı rasyonel tasarım, enzimlerin dizisini ve yapısını değiştirmek için uygulanabilir. Bu tez çalışmasında, yeni bir esteraz enziminin üç boyutlu yapısı hakkında tahmin edilen bilgiler, rasyonel tasarım yaklaşımına dayanan bölgeye yönelik mutasyon yöntemi kullanılarak aydınlatılmaya çalışılmıştır. Bölgeye yönelik mutasyon yöntemi ile ilgili genel yaklaşım, yapısal bilgi ve aktif bölge çalışmalarına dayanmaktadır. Bu strateji, enzim - substrat kompleksi, kofaktör özgünlüğü ve aktivite çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Bölgeye yönelik mutasyon kullanılarak gerçekleştirilen amino asit dizisindeki yapılan değişikliklerin sonucunda, elektrokimyasal etkileşimlerde farklılıklar oluşabilir. İstenen mutasyonu elde etmek için tasarlanan primerler, PZR tekniği ile gerçekleşen deneysel çalışmalar ile hedeflenen bölgelere bağlanır. Bölgeye yönelik mutasyon, genler üzerinde yapılan modifikasyon çalışmaları ve enzimlerin katalitik mekanizmaları incelenerek bir proteinin yapı-fonksiyon ilişkisinin çözümü için çok değerli bir yöntemdir. Enzimlerdeki belirli özellikler, bölgeye yönelik mutasyon ve diğer farklı protein mühendisliği stratejilerinin başarılı kombinasyonları ile geliştirilebilir. Daha önceki çalışmalarda Acıgöl'den toplanan mikroorganizma kültürlerinden izole edilmiş olan esteraz kodlayan gen, pET28-a vektörüne aktarılarak kompetan C43 hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, PZR reaksiyonlarında kalıp (template) DNA'sı olarak esteraz genini içeren pET28-a plazmidi kullanılmıştır. Esteraz geninin protein dizisi translasyonu ExPASy programı ile yapılmıştır. Daha sonra, SWISS Model yazılımı kullanılarak protein dizi karşılaştırması yapılmıştır. "Protein Data Bank" veri tabanında en yakın tahmini üç boyutlu yapı ve protein araştırılmış, en yakın proteinin %34 benzerlik oranı ile, Escherichia coli (Ec_ybfF)' den elde edilmiş olan esteraz ybfF proteini olduğu görülmüştür. Esteraz ybfF proteininin aktif bölgesindeki aminoasitlerle (H234 ve S206) çalışmada elde edilen proteinin belli bir bölgesindeki aminoasitlerin (H237 ve S87) benzerlik gösterdiği farkedilmiştir. Bu nedenle, H237 ve S87 amino asitlerinin yeni enzimimizin katalitik üçlüsünün üyeleri olduğu hipotezinin doğrulanması için PZR temelli bir yöntem olan bölgeye özel alanin taraması uygulanmıştır. Alanin tarama tekniği, belirli bir pozisyondaki hedef amino asidin katalitik ve fonksiyonel rolünü tanımlamak için kullanılır. Özellikle, hedef amino asit kalıntılarının alanin amino asiti ile sistematik olarak değiştirilmesiyle bilinmeyen yapıdaki proteinlerde katalitik aktiviteye katılan kritik amino asitleri tanımlamak için kullanılır. QuikChange® ile tasarlanan primerler ile gerçekleştirilen PZR reaksiyonlarıyla hedef amino asitlerin alanin ile değiştirilmesinin sebebi alanin'in -R grubundaki metilin yüklü olmaması ve hacimsel olarak uygun büyüklükte olmasıdır. Böylece alanin amino asidi, proteinin ana zincirinin konformasyonunu değiştirmez ve elektro kimyasal değişimlere neden olmaz. Ayrıca protein katlanması ve stabilitesi ile üç boyutlu yapıda orijinal tip protein ile kıyaslandığında ciddi değişime uğramaz. Mutant amplikonlar, mutasyona uğramamış DNA'yı uzaklaştırmak için metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi olan DpnI ile parçalanmıştır. Daha sonra DpnI kesimi uygulanmış PZR ürünlerinin C43 kompetan hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kültürler 100 µg/ml kanamisin içeren LB agar platelere ekilmiş ve gece boyunca 37 °C' de inkübe edilmiştir. Plazmid izolasyonu sonrası, agaroz jel elektroforezi yapılmıştır. Mutasyon kontrolü için, örneklerin DNA dizi analizi yapılmış ve istenen mutasyonu içeren plazmidlerle protein ekspresyon aşamalarına başlanmıştır. Başlangıçta, 0.01 mM IPTG ilave edildikten sonra 30 °C'de 6 saatlik inkübasyon ile ekspresyonu indüklenmiştir. Ardından 6xHis tag prosedürü ile H237A ve S87A mutant esteraz geni taşıyan pET28 vektörünün proteinlerinin saflaştırılması gerçekleştirilmiş ve kontrolü SDS-PAGE analizi ile yapılmıştır. IPTG ile gen ekspresyonu indüksiyonu sonrası H237A ve S87A için 25-35 kDa aralığında bantlar tespit edilmiştir. Esterazların molekül ağırlığının 27-54 kDa arasında değiştiği bilindiğinden sonucun doğru olduğu tespit edilmiştir. Sonraki aşamada elde edilen proteini saflaştırmak için santrifüjlü ultrafiltrasyon yapılmıştır. Bradford protein analizi ile konsantrasyon ölçümü yapılmış olup, S87A mutant esteraz için 1.3mg / ml, H237A mutant esteraz için 4.5 mg / ml ve orijinal tip için 5.5 mg / ml olarak ölçülmüştür. Orijinal tip enzim ve mutant enzimlerinin kinetik ölçüm analizi, pH8' de ve substrat olarak 1 mM Para-nitrofenol (pNP) kullanılarak 410 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Her biri 30 º C'de 20 dakika boyunca inkübe edilen enzimlere ait üçlü enzimatik aktivite ölçümleri, ayrı ayrı üç bağımsız deney seti şeklinde gerçekleştirilmiştir. IPTG ile gen ekspresyonu indüksiyonu sonrası H237A ve S87A için 25-35 kDa aralığında bantlar tespit edilmiştir. Esterazların molekül ağırlığının 27-54 kDa arasında değiştiği bilindiğinden sonucun doğru olduğu tespit edilmiştir. Sonraki aşamada elde edilen proteini saflaştırmak için santrifüjlü ultrafiltrasyon yapılmıştır. Bradford protein analizi ile konsantrasyon ölçümü yapılmış olup, S87A mutant esteraz için 1.3mg / ml, H237A mutant esteraz için 4.5 mg / ml ve orijinal tip için 5.5 mg / ml olarak ölçülmüştür. Orijinal tip enzim ve mutant enzimlerinin kinetik ölçüm analizi, pH8' de ve substrat olarak 1 mM Para-nitrofenol (pNP) kullanılarak 410 nm dalga boyunda gerçekleştirilmiştir. Her biri 30 º C'de 20 dakika boyunca inkübe edilen enzimlere ait üçlü enzimatik aktivite ölçümleri, ayrı ayrı üç bağımsız deney seti şeklinde gerçekleştirilmiştir. Kinetik ölçüm sonucunda, pH237A mutant esteraz ve S87A mutant esteraz enzimlerinin orijinal tip esterazın sahip olduğu katalitik aktiviteye sahip olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma ile, yeni bir esteraz enziminin sırasıyla 87. ve 237. pozisyonlarında bulunan Serin ve Histidin amino asitlerinin enzimin katalitik aktivitesinden sorumlu olan katalik üçlünün üyeleri oldukları kanıtlanmıştır. Yeni bir esteraz enziminin yapısal ve fonksiyonel özelliği hakkında edinilen bu bilgiler, alternatif protein mühendisliği yöntemlerinin kullanılarak ayrıntılı yapı - fonksiyon analizine dayalı istenilen özelliklerin geliştirilmesini hedefleyen, ileride yapılacak çalışmalara yön gösterici olarak kullanılabilecektir.