Tez Arşivi

Tez aramanızı kolaylaştıracak arama motoru. Yazar, danışman, başlık ve özete göre tezleri arayabilirsiniz.


Koç Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı

Generation of a CRISPR/Cas based genome editing system for MEFV gene in familial mediterranean fever-specific induced pluripotent stem cells

Ailesel Akdeniz ateşine özgü uyarılmış pluripotent kök hücrelerdeki MEFV geni için CRISPR/Cas temelli genom yazılım sisteminin oluşturulması

Teze Git (tez.yok.gov.tr)

Bu tezin tam metni bu sitede bulunmamaktadır. Teze erişmek için tıklayın. Eğer tez bulunamazsa, YÖK Tez Merkezi tarama bölümünde 418841 tez numarasıyla arayabilirsiniz.

Özet:

The ability to derive induced pluripotent stem cells (iPSCs) from any individual has opened up the possibility to generate patient- and disease-specific cell culture models. Such models facilitate research into disease mechanisms and provide a platform for in vitro drug screens. A drawback of disease-specific iPSC models is the lack of genetically matched controls. Recent implementation of bacterial adaptive immune system known as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) systems in mammalian cells as a new genome editing tool has provided unparalleled simplicity and precision to introduce site-specific changes into host DNA. A central aim of this thesis was to generate tools to implement a Crispr/Cas9 based system in an iPSC model of genetic inflammatory disease with a goal to replace disease-causing allele with its wild type counterpart. Familial Mediterranean Fever (FMF) is a autosomal recessive autoinflammatory disease caused by the mutations in the mefv gene. FMF has a high carrier rate in Turkey and the most severe form of the disease result from homozygous M694V mutations. iPSCs were derived from one such FMF patient and the presence of the disease-associated mutations was confirmed by DNA sequencing. To target the disease allele, single chimeric guide RNAs targeting mefv sequence at the vicinity of the M694V mutation were designed and cloned into expression vectors. The functionality of Crispr/Cas9 components in mammalian cells were confirmed using a Green fluorescent protein (GFP) reporter assay in 293T cells. To monitor homologous recombination (HR), a reporter construct in which GFP sequence was interrupted by the targeted mefv sequences was generated. Different HR donor templates were tested and linearized plasmids were observed to be the most efficient. Next, the ability of the selected guide RNAs to cleave the endogenous mefv locus was confirmed by a mismatch-specific DNA endonuclease assay. However, we failed to detect a corrected allele upon introduction of the Crispr components and a repair template bearing the wild type mefv exon 10 sequences into patient-specific iPSCs. To facilitate detection of corrected allele, a new donor template bearing silent mutations that create new restriction sites was designed. This donor template will enable the use of restriction fragment length polymorphism assay (RFLP) for screening rare iPSC clones that are successfully corrected.

Summary:

Herhangi bir bireyden uyarılmış pluripotent kök hücre türetilebilmesi, hastaya ve hastalığa özgü hücre kültürü modellemelerinin oluşmasına olanak sağlamıştır. Bu tür modeller hastalık mekanizmalarına yönelik araştırmayı hızlandırmış, yapay koşullarda ilaç taramalarının yapılabilmesi için platform sağlamıştır. Hastalığa özgü uyarılmış pluripotent kök hücre modellemelerinin güçlüklerinden biri genetik olarak eşit kontrollerin yokluğudur. Yakın zamanda bakteriye ait edinilmiş bağışıklık sisteminin (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) systems) memeli hücrelerine uygulabilir kılınması yeni bir genom yazılımını türetmiş olup konak DNA'ya sekansa özgü değişimler oluşturabilmesi için basitlik ve kesinlik sağlamıştır. Bu tezde ana amaç Crispr/Cas9'a dayalı bir sistemin ateşli genetik bir hastalığın uyarılmış pluripotent kök hücre modelinde uygulanabilmesi için araçlar oluşturmak ve hastalığa neden olan aleli yabanıl tip kopyasıyla değiştirmektir. Ailesel Akdeniz Ateşi mefv genindeki mutasyonlar sonucu ortaya çıkan otozomal çekinik otoinflamatuvar bir hastalıktır. Ailesel Akdeniz Ateşi Türkiye'de yüksek bir taşıyıcı oranına sahiptir ve hastalığın en ciddi biçimi M694V homozigot mutasyonlarda görülür. Bu durumdaki bir hastadan türetilen uyarılmış pluripotent kök hücreler ve hastalığa neden olan mutasyonlar DNA dizilemesiyle gösterilmiştir. Mutasyonlu aleli hedeflemek için mefv sekansını hedefleyen M694V mutasyonu yakınında bulunan tek ve kimerik rehber RNA'ler tasarlanmıştır ve anlatım vektörlerinin içine kopyalanmıştır. Crispr/Cas9 parçalarının memeli hücrelerdeki işlevselliği yeşil floresan haberci proteini (GFP) analiziyle insan embryonal böbrek hücrelerinde doğrulanmıştır. Homolog rekombinasyonu gözlemleyebilmek için yeşil floresan haberci protein sekansı, hedeflenmiş mefv sekansı tarafından sekteye uğratılmış bir haberci vektör kullanılmıştır. Değişik homolog rekombinasyon donör vektörleri test edilmiş ve en verimli olarak linearize vekörler seçilmiştir. Daha sonra, seçilmiş rehber RNA'lerin endojen mefv lokusunu kesebilme kapasitesi DNA bazlarındaki uyumsuzluğa yönelik DNA endonükleaz analiziyle gösterilmiştir. Ancak Crispr parçalarının ve mefv geni 10. exon sekanslarını içeren onarım vektörünün hastaya özgü uyarılmış pluripotent kök hücrelerine verilmesinden sonra düzeltilmiş alel saptanamamıştır. Düzeltilmiş alelin saptanmasını kolaylaştırmak için, belirsiz mutasyonlar ve yeni restriksiyon bölgeleri taşıyan farklı bir onarım vektörü tasarlanmıştır. Tasarlanan bu donör vektör ile restriksiyon fragment length polimorfizm analizi (RFLP) yapılıp başarılı olarak düzeltilen seyrek olarak bulunan uyarılmış pluripotent kök hücre klonlarının taranması sağlanacaktır.