Tez Arşivi

Tez aramanızı kolaylaştıracak arama motoru. Yazar, danışman, başlık ve özete göre tezleri arayabilirsiniz.


İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Anabilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı

Investigation of MEFV gene expression and pyrin levels in familial mediterranean fever and behçet syndrome

Ailevi akdeniz ateşi hastalığı ve behçet sendromunda MEFV ekspresyonunun ve pirin seviyelerinin incelenmesi

Teze Git (tez.yok.gov.tr)

Bu tezin tam metni bu sitede bulunmamaktadır. Teze erişmek için tıklayın. Eğer tez bulunamazsa, YÖK Tez Merkezi tarama bölümünde 558779 tez numarasıyla arayabilirsiniz.

Özet:

Mediterranean Fever (MEFV) gene, which is located on the short arm of chromosome 16, at the position of 13.3. This gene has 10 exons and more than 300 variations have been noted in Infevers database up to present. The MEFV gene encodes pyrin/marenostrin protein consisting 781 amino acids (a.a). To date, several MEFV alternative spliced transcripts have been found and, one of these transcripts is MEFV-Δ2 which is formed with the absence of the exon 2 encodes the pyrin protein in 570 a.a length. The role of pyrin protein in inflammasome pathway has been investigated by various research groups. According to controversial studies, pyrin can act in inflammasome as a proinflammatory or anti-inflammatory protein. Moreover, the pyrin could have a functions in an apoptosis pathway by binding to ASC modulator protein and existing the speck formation. Although existing of several study findings based on the role of pyrin in inflammasome, the exact functions of it has not been explained yet. The MEFV gene mainly expressed in monocytes, neutrophils, eosinophils, dendritic cells, and synovial fibroblasts and, many studies showed that the expression rate could be altered by MEFV variations. There are common MEFV variations located in exon 2 (E148Q, R202Q) and located in exon 10 (M694V, M680I, M694I, V726A). Among the MEFV variations, M694V, M694I, M680I, and V726A located exon 10 have been reported as most linked pathogenic variations with Familial Mediterranean Fever (FMF) disease which one of the autoinflammatory disease. While, the E148Q variation type located exon 2 of MEFV has been observed both in FMF patients and in the general population, M694, M680I, and V726A variations have been seen in FMF patients more than healthy controls, according to many studies. Whereas, the E148Q one has been linked to the milder phenotype of the disease, the M694V has been correlated with disease-causing variation because of the high frequency of this variant in FMF disease compared to other variations. In contrast to typical autosomal recessive Mendelian inherited disease, there are many FMF patients have typical FMF clinical manifestations but they do not have any variations in the MEFV gene. This situation makes challenging to get diagnose, accurately as FMF for patients. Furthermore, there are several studies based on the MEFV gene expression levels between FMF patients and healthy groups. One study reported that FMF patients have decreased the MEFV gene expression compared to healthy controls. In addition to that, while the expression level of FMF patients who have M694V variation was found decreased, the mRNA expression level was observed higher in patients carrying E148Q variation than patients who carry M694V variation. Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autoinflammatory disease with an autosomal recessive mode of inheritance. Even though the FMF disease has been observed in various countries, it affects mainly Turks, Arab, Armenian and Jews. The disease is characterized by several inflammation symptoms such as periodic attacks of fever, peritonitis, joint, chest and abdominal pain. Such attacks of FMF patients can be cured by colchicine therapy but the colchicine can not help to many patients, who have resistance to colchicine medicine, to cure the attacks of disease. Therefore, many alternative treatments such as IFN-α, Anakinra or Canakinumab has been used for patients who non-response to colchicine. Further, the FMF disease shares the typical clinical findings with severe disorders such as TRAPS, CAPS, HIDS or Behçet syndrome and, MEFV variations also observed in severe inflammatory diseases such as JIA, MKD, CAPS and BS. Behçet syndrome (BS) is a multisystemic inflammatory disorder with uncleared etiology to date. BS has similar ethnicity, clinical findings of patients and treatment options with FMF disease, and BS mainly affects Saudi Arabia, Korea, China, but greatly Turks populations. Even if, the HLA-B51 has been most associated allele for Behçet syndrome, the exact genetic factors have not been clarified yet. There are several studies based on the MEFV variation in BS patients. BS patients could have several MEFV variations such as M694V, V726A, and E148Q with respect to the findings of many studies in recent years. In this context, the aim of this thesis study is to analyze the MEFV gene expression levels and pyrin levels among the FMF and Behçet syndrome group and healthy control group. The expression levels of MEFV transcripts have been determined by using the leukocyte samples of patients and healthy controls with the SYBR green-based qPCR method. To quantify the whole MEFV transcripts among the 3 different groups, the specific MEFV primer targeting the exon 4-5 junction was performed. To investigate the pyrin protein and IL1-β levels, western blot method was performed using the specific antibodies. The MEFV genotypes of Behçet patients and healthy controls were analyzed with the sanger sequencing. It was found that 6 of 14 Behçet patients have MEFV variations at least in MEFV gene. Healthy controls who have any MEFV variations were discarded from the study. As FMF patients are available with MEFV genetic test results, clinically, genotyping was not applied to FMF patients. The MEFV gene expression experiment were performed with qPCR method. However, no significant differences were found statistically among FMF (p=0.3348), Behçet (p=0.2903) and healthy groups but, it was revealed that the MEFV gene expression levels of FMF and Behçet patients were similar and a little reduced compared to healthy control group expression level (p=0.3801). The pyrin and IL1β levels were not visualized via western blotting method because of the poor quality of protein samples and a thought of possibility of protein degradation. Therefore, the protein level analysis was not completed.

Summary:

Akdeniz ateşi (MEFV) geni, 16. kromozomun kısa kolunda 13.3 pozisyonunda bulunmaktadır. Toplamda 10 ekzonu olan MEFV geni, 781 amino asitten (a.a) oluşan pirin/marenostrin proteinini kodlamaktadır. MEFV geni 3.5 kb uzunluğunda full length transkript kodlamasına rağmen, bugüne kadar çeşitli MEFV alternatif kırpılma transkriptlerinin olduğu bulunmuştur. Alternatif transkriptlerinden bir tanesi, ekzon 2 bölgesinin alternatif kırpılma sonucuyla oluşan MEFV-d2 (MEFV-Δ2)'dir ve 570 aminoasit uzunluğunda pirin proteini kodlamaktadır. MEFV-d2 transkript ile birlikte MEFV-2a, MEFV4a gibi birçok izoformlar da MEFV-d2'nin bulunmasıyla tanımlanmaya başlanmıştır. MEFV geni esas olarak monositlerde, nötrofillerde, eozinofillerde, dendritik hücrelerde ve sinovyal fibroblastlarda eksprese olduğu bulunmuştur. Infevers veritabanına göre, MEFV geninin 300'den fazla varyasyona sahip olduğu ve bu varyasyonların içerisinden, ekzon 2'de bulunan E148Q, R202Q ve ekzon 10'da bulunan M694V, M694I, M680I ve V726A'nın AAA hastalarında diğer varyasyonlara kıyasla daha çok görülen varyasyonlar olduğu gözlemlenmiştir. E148Q varyasyonu hem hastalarda hem de genel popülasyonda sıklıkla gözlemlenen bir varyasyondur. Ekzon 10'da bulunan M694V, M680I ve V726A varyasyonları ise AAA hastalarında sağlıklı kontrollerden daha fazla görülmesinden ve Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA) hastalığının klinik semptomları ile daha fazla ilişkilendirildiklerinden dolayı bu hastalık için patojenik varyasyonlar olarak görülmektedirler. Yapılan bazı çalışmalarda, E148Q varyasyonuna sahip olan hastaların daha hafif bir hastalık fenotipi gösterdiği, M694V varyasyonu taşıyan AAA hastalarında ise diğer varyantlara oranla hastalığın fenotipiyle daha ilişkili olduğu ve bu varyasyonu, özellikle homozigot olarak, taşıyan hastaların amiloidoz hastalığı riskinin bulunduğu gözlemlenmiştir. Buna karşın, tipik AAA klinik semptomları gösteren fakat MEFV geninde herhangi bir patojenik varyasyon taşımayan hastalar da mevcuttur. Bu yüzden hastalığın tanı sırasında kullanılan MEFV genetik tanı testi bu tür hastaların tanısı için kesin bir sonuç verememektedir. Bu durum, otozomal resesif geçiş gösteren kalıtsal Mendel hastalıklarında gözlemlenen modele uymadığı da gözlemlenmiştir. Bugüne kadar yapılan çeşitli ekspresyon çalışmalarında AAA hastalarının MEFV gen ekspresyonunun sağlıklı kontrollere kıyasla daha az olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, M694V varyasyonuna sahip olan AAA hastalarının ekspresyon seviyesi düşük bulunurken, E148Q varyasyonunu taşıyan hastalarda mRNA ekspresyon seviyesinin M694V taşıyan hastalara kıyasla daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Pirin proteininin inflamasyon yolağındaki rolü, çeşitli araştırma grupları tarafından incelenmiştir. Yapılan bazı çalışmalara göre, pirin proteini, iltihaplanmaya neden olduğu gözlenirken, bazı çalışmalarda ise iltihap önleyici protein olarak görev yaptığı ifade edilmiştir. Bununla birlikte, pirin proteininin, ASC modülatör proteinine bağlanarak, partikül oluşumu üzerinden apoptoz yolağında da görevli olduğu düşünülmektedir. Her ne kadar pirinin iltihaplanmadaki rolüne dayanan farklı araştırmalar bulunmasına rağmen, inflamasyon yolağındaki fonksiyonu henüz net olarak bilinmemekte ve araştırmalar devam etmektedir. Ailevi Akdeniz Ateşi (AAA), otozomal resesif kalıtılan, otoinflamatuvar bir hastalıktır. AAA hastalığı çeşitli ülkelerde görülmesine rağmen, çoğunlukla Türkleri, Arap, Ermeni ve Yahudileri etkilemektedir. Hastalık klinik olarak periyodik ateş atakları, peritonit, eklem, göğüs ve karın ağrısı gibi çeşitli iltihap belirtileri ile karakterize edilir. AAA hastalarının çeşitli klinik semptomları genellikle anti-inflamatuvar kolşisin ilacı ile tedavi edilmektedir. Fakat bu tedavi, kolşisin ilacına karşı direnç gösteren hastalarda etkili bir biçimde semptomları iyileştirmek veya önlemek amacıyla tedaviye yardımcı olamamaktadır. IFN-α, Anakinra veya Canakinumab gibi birçok alternatif tedaviler bu tip hastalar için günümüzde yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır. AAA hastalığı, TRAPS, CAPS, HIDS veya Behçet sendromu gibi diğer hastalıklarla tipik klinik bulgularını paylaştığı bilinmekte ve bazı MEFV varyasyonlarının Behçet sendromu, Romatoid artrit, Crohn's hastalığı (CD), gut and Erişkin Still hastalığı gibi bazı hastalıklarda da bulunduğu ifade edilmiştir. Behçet sendromu (BS) multisistemik inflamatuvar bir hastalık olmakla birlikte, etiyolojisi henüz bilinmemektedir. BS hastalığı, AAA hastalığıyla benzer etnik kökene, hastaların klinik bulgularına ve benzer tedavi seçeneklerine sahiptir. Epidemiyolojik olarak BS genellikle Suudi Arabistan, Kore, Çin ve önemli bir ölçüde Türk nüfusunu etkilemektedir. HLA-B51 allel, Behçet sendromu ile en çok ilişkilendirilen alt allel olmasına rağmen, hastalığa neden olabilecek olası genetik faktörler henüz bilinmemektedir. Son çalışmalara göre, BS hastalarında çeşitli MEFV varyasyonu tespit edilmiştir. Bu çalışmaların bulgularına göre, BS hastaları M694V, V726A ve E148Q gibi çeşitli MEFV varyasyonlarına sahip olabilmektedir. Yapılan bu tez çalışmasında, farklı genotiplere sahip olan AAA ve Behçet hastaları ile sağlıklı kontroller arasındaki MEFV gen ekspresyon seviyelerini ve pirin ile IL-1β proteinin çalışma grupları arasındaki seviyelerinin araştırılması amaçlanmaktadır. MEFV geninin ekspresyon seviyelerinin ve protein seviyelerinin belirlenmesi için lökosit hücreleri kullanılmıştır. MEFV transkriptlerini hasta ve sağlıklı kontrol grupları ile birlikte incelemek için, MEFV geninin ekzon 4-5 bölgesini hedef alan spesifik MEFV primerleri qPCR yöntemi için kullanılmıştır. Pirin proteini ve IL1-β seviyelerini belirlemek için spesifik antikorlar kullanılarak western blot yöntemi uygulanmıştır. Behçet ve sağlıklı kontrollerin MEFV genotiplerinin belirlenmesi için DNA örnekleri kullanılarak MEFV geni çoğaltılmıştır. Sanger sekans analizi sonucunda 14 Behçet hastasının 6 tanesinde MEFV varyasyonları bulunduğu tespit edilmiştir. Bütün sağlıklı kontrol grubuna ait DNA örnekleri de MEFV geni için sekanslanmış ve herhangi bir MEFV varyasyonu bulunması halinde örnekler çalışmadan çıkarılmıştır. Yapılan qPCR analizleri sonucunda AAA (p= 0.3348), Behçet hastaları (p= 0.2903) ve sağlıklı kontrol grupları arasında MEFV geni ekspresyonu açısından istatiksel olarak önemli bir sonuç bulunmamasına rağmen, AAA hastaları ile Behçet hastalarının birbirlerine benzer seviyede MEFV ekspresyonuna ve sağlıklı grubun ekspresyon seviyesine kıyasla daha az bir ekspresyon seviyesine sahip oldukları gözlemlenmiştir (p= 0.3801). Pirin proteini ve IL1β seviyelerinin belirlenmesi için western blotting yöntemi kullanılmış, fakat protein örneklerinin kalitelerinin düşük olması ve protein denatürasyonunun gerçekleşmiş olma ihtimalinden dolayı protein seviye belirleme analizleri yapılamamıştır. Farklı protein ve antikor konsantrasyonları denenmiş olmasına rağmen, beklenildiği gibi bir protein bant görüntüsü alınamadığından dolayı protein seviyeleri ölçülememiştir.